امام علی(ع) در صبحگاه نوزدهم ماه مبارک رمضان سال ۴۰ هجری زمانی که امام آماده می‌شد تا به سوی صفین حرکت کرده و جنگ جدیدی را با معاویه آغاز کند، توسط شقی‌ترین انسان‌ها، عبدالرحمان‌بن‌ملجم مرادی مجروح شده و سه روز بعد در ۲۱ رمضان به شهادت رسید.

روایات متعددی حکایت از آن دارد که امام در مدخل ورودی مسجد (در درون مسجد) مورد حمله ابن‌ملجم واقع شده است. در نقل‌های دیگری آمده است که امام در حال بیدار کردن مردم برای نماز بود که مورد حمله قرار گرفت. اما منابع موجود تاریخی بیشتر اشاره به نقل نخست کرده‌اند.

در برابر روایات دیگری وجود دارد که زمان حمله ابن‌ملجم را وقتی می‌داند که امام مشغول نماز بوده است. در نقلی از میثم تمار آمده است که امام نماز صبح را آغاز کرده و در حالی که یازده آیه از سوره انبیا خوانده بود. ابن‌ملجم با شمشیر ضربتی بر سر امام زد.

امام علی(ع) در سحرگاه ۱۹ رمضان سال ۴۰ قمری در مسجد کوفه در حال سجده، به دست ابن ملجم مرادی ضربت شمشیر خورد و دو روز بعد در ۲۱ رمضان به شهادت رسید و مخفیانه دفن شد. ضربت خوردن علی بن ابی‌طالب، در شرایطی رخ داد که پس از جنگ نهروان، وی می‌کوشید مردم عراق را برای جنگ دوباره با معاویه بسیج کند، اما تنها تعداد اندکی حاضر به یاری او شدند. در این حال، معاویه با آگاهی از اوضاع عراق، به نواحی مختلف حکومت امام علی(ع) در جزیرة العرب و عراق حمله کرد.

بنا بر منابع تاریخی، سه تن از خوارج برای کشتن سه نفر یعنی امام علی(ع)، معاویه و عمرو بن عاص توافق کردند. ابن ملجم مرادی مأمور قتل علی (ع)شد.

امام اول شیعیان پس از شهادت، چنان‌که خود وصیت کرده بود، توسط امام حسن (ع)، امام حسین(ع)، محمد بن حنفیه و با همراهی عبدالله بن جعفر، شبانه و مخفیانه در نجف کنونی (غریین در آن زمان) به خاک سپرده و قبرش مخفی شد.

مخفی کردن قبر امام علی(ع) به دلیل جلوگیری از نبش قبر و بی‌حرمتی توسط بنی‌امیه و خوارج دانسته شده است. امام صادق(ع) در سال ۱۳۵ قمری و زمان حکومت منصور عباسی، محل دفن امام علی(ع) را در نجف آشکار کرد.

علامه طبرسی در خصوص شهادت حضرت علی (ع) می‌گوید: علی (ع)شصت و سه سال عمر و پس از بعثت‌، بیست و سه سال با رسول خدا(ص)زندگانی را سپری کرد. سیزده سال در مکه پیش از هجرت در امتحان و گرفتاری به سر برد و سنگین‌ترین بار رسالت آن حضرت را به دوش کشید.